Оценка влияния Цитросепта® на разрастание дрожжеподобных грибков вида кандида альбиканс

Эльжбета Краевска-Кулак1, Цецилия Люкашук1, Йоланта Левко1, Вячеслав Ничипорук2, Гжегож Винтер3

• Отделение теории ухода за больными Белостокской медицинской академии (МА).
• Клиника дерматологии и венерологии Белостокской МА.
• Радомская воеводская специализированная больница.

Авторы этого труда выражают благодарность технику-аналитику Янине Годлевской за неоценимую помощь в проведении исследований.

ИЗЛОЖЕНИЕ

Вступление - Цитросепт был открыт в 1980 г. американским врачом-иммунологом Джейкобом Хэричем.

Цель работы - Целью работы была начальная оценка влияния цитросепта на разрастание дрожжеподобных грибков вида кандида альбиканс

Материал и методика - Исследования проводились с 50 образцами кандиды альбиканс, выделенными из различных онтоценозов пациентов с активными симптомами кандидоза. Для опытов применялся 33% экстракт грейпфрута в водном растворе растительного глицерина (Цитросепт® Чинтамани Норвегия), итраконазол, кетоконазол и флюконазол. Оценки чувствительности осуществлялись методом последовательного разбавления. Была обозначена минимальная сдерживающая концентрация (Minimal Inhibitory Concentrations - MIC) в мг/л на классическом субстрате Sabouraud (Bio-Rad), и субстрате YNB (Краковский коммерческий дом науки Польской академии наук).

Результаты: На субстрате Sabouraud средняя MIC Цитросепта составила 6,25 мг/л, итраконазола 89,61 мг/л, флюконазола 87,31 мг/л и кетоконазола 8,52 мг/л. На субстрате YNB получена средняя MIC Цитросепта 2,13 мг/л, итраконазола 169,5 мг/л, флюконазола 200 мг/л и кетоконазола 55,38 мг/л.

Подтверждена существенная статистическая разница средних значений MIC для образцов кандиды альбиканс на субстрате Sabouraud между Цитросептом и итраконазолом и флюконазолом (р<0,001), на субстрате YNB между Цитросептом и итраконазолом, флюконазолом и кетоконазолом (р<0,001). Также выявлена существенная статистическая разница между MIC на субстрате Sabouraud и YNB для Цитросепта (р<0,005), итраконазола, флюконазола и кетоконазола (р<0,001). 

Выводы: Представляется, что Цитросепт оказывает противогрибковое воздействие в отношении кандиды альбиканс.

Показаны дальнейшие расширенные исследования с большим количеством образцов и других видов грибков.

Грейпфрут (Citrus paradisi) является вечнозеленым фруктовым деревом из группы цитрусов, открытым в середине XVIII века на острове Барбадос. Не бывает дикорастущим. В настоящее время является одним из самых популярных цитрусовых плодов, разводимых в субтропических районах Америки и Азии. 

Плоды грейпфрута ценятся за вкусовые и диетически-оздоровительные качества. В Соединенных Штатах они составляют ежедневный компонент здоровой диеты. Считается, что грейпфруты лучше всего помогают правильному функционированию кровеносной системы. Содержащиеся в них питательные компоненты способствуют обмену веществ, регулируют пищеварение и уровень холестерина в крови, а также предотвращают окисление его фракции LDL. Сок плодов грейпфрута прекрасно утоляет жажду и оказывает освежающее действие в жару. 

Впервые грейпфрут в медицину ввел римский натуралист Плиний. В 310 г. до н.э. на его положительный лечебный эффект также обратил внимание греческий историк Теофраст (1).
Экстракт флавонойдов - Цитросепт был открыт в 1980 г. американским врачом-иммунологом Джейкобом Хэричем и сразу пробудил огромную заинтересованность, прежде всего, в медицинском мире, но также и в таких сферах, как земледелие, животноводство, здравоохранение, косметическая промышленность, пищевая промышленность и др. (1, 2, 3). Цитросепт содержит соединения, необходимые для создания антител (посредством чего помогает иммунной системе), обуславливающие хорошее состояние кровеносных сосудов, уплотняющие и укрепляющие их, регулирующие метаболические процессы, связывающие свободные радикалы, замедляющие процессы старения (1). Он также помогает функциям печени, очищая организм от ядов и токсинов (1). Экстракт из твердых частиц грейпфрута содержит в себе также несколько десятков других веществ антибиотического и уничтожающего грибки воздействия(1).
Много лет Цитросепт применяется натуротерапевтами при лечении различных заболеваний человека. Он причисляется к сильнодействующим антибактериальным, противогрибковым средствам, его считают самым популярным лекарством при заражениях пищеварительного тракта, вызванных грибком кандида альбиканс (1).
Все чаще достоинства Цитросепта находят оценку также и в традиционной медицине. Чжао с соавторами показали, что процианидины, присутствующие в зернах грейпфрута, оказывают противовоспалительное, антиревматическое, антиаллергическое воздействие, тормозят негативное влияние ультрафиолетового излучения на кожу (блокируют синтез свободных радикалов) (4). Опытами на живых мышах вышеупомянутые авторы подтвердили, что наружное применение экстракта грейпфрута значительно ограничивает рост новообразований на коже (4). Кастильо с соавторами подобными опытами продемонстрировали, что процианидины дают защитный эффект от радиации (5). В парижском Институте Пастера проводились исследования с применением экстракта при лечении ВИЧ-инфекции (1).

Целью работы была начальная оценка влияния Цитросепта на разрастание дрожжеподобных грибков вида кандида альбиканс.

Материал и методика

Исследованием охвачено 50 образцов кандиды альбиканс. Грибки отобраны путем мазков из различных онтоценозов (ротовой полости, влагалища, уретры, кала) пациентов с активными симптомами кандидоза. Идентификация дрожжеподобных грибков проводилась с использованием субстрата CandiSelect (Bio-Rad).

Для опытов использовались образцы грибков, характеризующиеся многообразной сопротивляемостью опытным химиотерапевтическим противогрибковым средствам, оцениваемой методом FUNGITEST® (Bio-Rad).

Для опытов применялись Цитросепт в водном растворе растительного глицерина (Цитросепт® Чинтамани), итраконазол, кетоконазол и флюконазол.

Оценки чувствительности осуществлялись методом последовательного разбавления (Plate Dilution Method). Обозначена была минимальная сдерживающая концентрация (Minimal Inhibitory Concentrations - MIC) в мг/л на классическом субстрате Sabouraud (Bio-Rad) и субстрате YNB (Краковский коммерческий дом науки Польской академии наук).

Все препараты растворялись в 1% растворе DMSO. Субстраты, на которых обозначалась чувствительность к препаратам, разливались по 15 мл на пластинки Петри диаметром 9 см, содержащие растворенный испытуемый препарат.

После застывания субстратов на пластинках последовательно располагались испытуемые препараты с концентрацией от 200 до 0,025 миллиграмма на литр питательной среды (мг/л). Эмульсия для исследования чувствительности к упомянутым препаратам добывалась из чистых выращенных за 24 часа образцов дрожжеподобных грибков. Плотность эмульсии определялась с использованием денситометра (BioMerieux) и устанавливалась на уровне примерно 105 клеток на 1 мл физиологической соли. Приготовленные эмульсии высеивались на пластинки Петри с вышеупомянутыми субстратами, содержащими возрастающие концентрации препарата. Первую контрольную группу составляли посевы испытуемых образцов на испытуемых субстратах, не содержащих препарата, вторую группу - на субстратах, содержащих 1% раствор DMSO. Все результаты снимались после 24-часовой инкубации при температуре 37°С.

Статистический анализ проводился с использованием теста-т для независимых проб с помощью компьютерной программы Statistica 5.1. Результаты признавались как статистически характерные, когда значение р<0,05.

Результаты

MIC Цитросепта на субстрате Sabouraud колебалась от 1 до 50 мг/л, итраконазола от 0,25 до 200 мг/л, флюконазола от 0,5 до 200 мг/л и кетоконазола от 0,05 до 50 мг/л (таблица 1).

На субстрате YNB MIC Цитросепта разместилась в интервале от 0,05 до 12,5 мг/л, итраконазола от 25 до 200 мг/л, флюконазола составила 200 мг/л и кетоконазола от 6,25 до 100 мг/л (таблица 2).

На субстрате Sabouraud средняя MIC экстракта грейпфрута составила 6,25 мг/л, итраконазола 89,61 мг/л, флюконазола 87,31 мг/л и кетоконазола 8,52 мг/л (таблица 4, диаграмма 1).

На субстрате YNB средняя MIC Цитросепта определена в 2,13 мг/л, итраконазола - 169,5 мг/л, флюконазола - 200 мг/л и кетоконазола - 55,38 мг/л (таблица 3, диаграмма 1).

Подтверждена существенная статистическая разница средних значений минимальных концентраций, сдерживающих разрастание кандиды альбиканс на субстрате Sabouraud между Цитросептом и итраконазолом и флюконазолом (р<0,001), на субстрате YNB между Цитросептом и итраконазолом, флюконазолом и кетоконазолом (р<0,001). Продемонстрирована также существенная статистическая разница между MIC на субстрате Sabouraud и MIC на субстрате YNB для Цитросепта (р<0,005), итраконазола, флюконазола и кетоконазола (р<0,001) (таблица 3).

Дискуссия

Микологическая литература посвящает все больше места проблеме сопротивляемости и уменьшившейся чувствительности грибков к повсеместно применяемым противогрибковым лекарствам. У грибков выделяются два типа сопротивляемости антимикотикам: первичный и вторичный (индуцированный) (6). Примеры первичной и вторичной сопротивляемости подробно описаны, напр., по отношению к 5-флюороцитозину. Виды Candida glabrata и Candida krusei оказывают первичную сопротивляемость по отношению к флюконазолу, а Clavispora lusitanie - амфотерицину В (7). Оронсо с соавторами усматривают отсутствие чувствительности к флюконазолу в 15 - 46-кратном увеличении активности цитохрома Р-450 в клетках образцов Candida krusei, устойчивых к этому препарату, в сравнении с чувствительными образцами кандиды альбиканс (8). На основании наших нынешних результатов ясно видна нарастающая сопротивляемость все более широко применяемым итраконазолу и флюконазолу (высокие MIC на обоих исследуемых субстратах). MIC кетоконазола, который обычно реже дают пациентам, на обоих субстратах заметно ниже, чем у вышеупомянутых препаратов.

Появление сопротивляемости к противогрибковым химиотерапевтикам, все более частое возникновение штаммов с уменьшенной чувствительностью, а также подтверждение разницы в чувствительности между видами и подвидами в пределах одного и того же вида вызывают необходимость поиска новых препаратов, оказывающих противогрибковое воздействие. Похоже, что одним из таких препаратов может быть Цитросепт.

В состав грейпфрутового сока входят флавоноиды (нарингенин, нарингин, кверецитин, камферол), минеральные соли, витамины и вода (7). Исследования последних лет показали, что флавоноиды и фуранокумарины грейпфрутового сока обладают способностью задерживать энзимы цитохрома Р-450 в печени и пищеварительном тракте (10, 11).

Цитохром Р-450 (CYP) является системой энзимов (монооксигеназов) со сложной функцией, локализованных в гладких мышцах, главным образом в печени и тонкой кишке. Эти энзимы ответственны за оксидацию (фаза 1) метаболизма многих химических соединений в этом препарате.

В последние годы значительно выросла заинтересованность, связанная с ролью CYP, в отношении интеракции препаратов, их токсичности и  участию в возникновении карциногенных веществ (11, 12, 13).

Профессиональная микологическая литература не содержит обширных данных на тему противогрибкового действия экстракта грейпфрута (11, 14).

Шалев с соавторами сравнивали противогрибковые свойства 10% экстракта из семян грейпфрута и 10% экстрактов других цитрусовых (14). Исследовались пять видов дерматофитов и два подвида дрожжеобразных грибков. Авторы показали, что шесть различных экстрактов цитрусовых задерживали рост дерматофитов, но не влияли на рост дрожжеобразных грибков (14). В нашем случае исследования касались образцов кандида альбиканс. Полученные результаты весьма обнадеживающи. Минимальные задерживающие рост кандиды альбиканс концентрации исследуемого нами Цитросепта были статистически значительно ниже в сравнении с обычно применяемыми противогрибковыми лекарствами.

Следует помнить, что при оценке противогрибковых лекарств надо принимать во внимание множество факторов, ответственных при исследованиях за чувствительность образцов. К самым важным относятся: правильный подбор животного субстрата, время инкубации и величина прививаемой дозы, а также метод оценки активности исследуемого противогрибкового химиотерапевтика (15, 16, 17, 18). Методом, рекомендуемым для обозначения чувствительности грибков к антимикотикам, считается макрометод разбавления препарата в жидком субстрате RPMI (19). Однако не существует строго установленной стандартизации способов определения чувствительности к препаратам в микологии. Среди методик, применяемых с этой целью, выделяются: микрометод разбавления, оценивающий наименьшую концентрацию, задерживающую рост микробов (MIC), метод разбавления препарата в твердом субстрате, метод разбавления препарата в твердом субстрате при охлаждении, диффузионно-кружковый метод, или Е-тесты (19).

В нашем случае применялся метод разбавления с использованием субстратов Sabouraud и YNB. Исследуя чувствительность образцов кандиды альбиканс к 33% экстракту грейпфрута, мы получили на субстрате YNB троекратное уменьшение средних значений MIC в мг/л по отношению к средним значениям MIC на субстрате Sabouraud. Это подтверждает предшествующие наши и других авторов наблюдения, утверждающие, что чувствительность грибков к противогрибковым химиотерапевтикам зависит от рода используемого субстрата (15, 16, 17, 18).

Цитросепт весьма широко применяется при холистическом лечении различных заболеваний. Формальные же научные данные основываются на отдельных клинических испытаниях, что вызывает необходимость дальнейших расширенных исследований с использованием этого препарата. 

Выводы

• Представляется, что 33% Цитросепт оказывает противогрибковое воздействие по отношению к кандиде альбиканс.
• Показаны дальнейшие расширенные исследования с большим количеством образцов и других видов грибков.

Таблица 1 Значения минимальных концентраций, задерживающих рост 50 образцов кандиды альбиканс на субстрате Sabouraud
Table 1 Minimal inhibition concentrations values of 50 strains of Candida albicans on Sabouraud medium

Таблица 2 Значения минимальных концентраций, задерживающих рост 50 образцов кандиды альбиканс на субстрате YNB.
Table 2 Minimal inhibition concentrations values of 50 strains of Candida albicans on YNB medium.

Таблица 3. Средние значения минимальных концентраций, задерживающих рост 50 образцов
 кандиды альбиканс на исследуемых субстратах

**p<0,001 для экстракта грейпфрута, °°p<0,001 для итраконазола, ##p<0,001 для флюконазола на субстрате Sabouraud
ssp<0,001 для экстракта грейпфрута, n np<0,001 для итраконазола, l lp<0,001 для флюконазола на субстрате YNB (тест-t)
*p<0,05 на субстрате Sabouraud для экстракта грейпфрута, p<0,001 на субстрате Sabouraud для итраконазола, ààp<0,001 на субстрате Sabouraud для флюконазола, ~p<0,001 на субстрате Sabouraud для кетоконазола (тест-t)

Диаграмма 1. Средние значения минимальных концентраций, задерживающих рост 50 образцов кандиды альбиканс на исследуемых субстратах

Figure 1. Mean minimal inhibition concentrations values of 50 Candida albicans strains on tested media

    Средний MIC, мг/л           Mean MIC, mg/L